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百瑞極——常見細(xì)胞器染色(3)--細(xì)胞核

常見細(xì)胞器染色(3)——細(xì)胞核



01

細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)


細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)有核膜、核仁、染色質(zhì)、核基質(zhì)。主要功能是遺傳物質(zhì)DNA儲存和復(fù)制的主要場所,是細(xì)胞遺傳和代謝的控制中心。

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1.核膜:雙層膜,其上有核孔,是細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的物質(zhì)交換通道,表現(xiàn)出明顯的選擇性,RNA、蛋白質(zhì)等大分子進(jìn)出必須通過核孔。

2.核仁:在細(xì)胞有絲分裂過程中周期性消失(前期)和重現(xiàn)(末期)。

3.染色質(zhì):能被堿性染料染成深色的物質(zhì),主要由DNA和蛋白質(zhì)組成。

4.核基質(zhì):是核中除染色質(zhì)與核仁以外的成分,包括核液與核骨架兩部分。

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02

細(xì)胞核的功能


控制細(xì)胞的遺傳,生長和發(fā)育。

細(xì)胞核是細(xì)胞的控制中心,一般說真核細(xì)胞失去細(xì)胞核后,很快就會死亡,但紅細(xì)胞失去核后還能生活120天;植物篩管細(xì)胞,失去核后,能活好幾年。


03

為什么要對細(xì)胞核染色?


從細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)可以看出,細(xì)胞核中最重要的結(jié)構(gòu)是染色質(zhì),染色質(zhì)的組成成分是蛋白質(zhì)分子和DNA分子,而DNA分子又是主要遺傳物質(zhì)。當(dāng)遺傳物質(zhì)向后代傳遞時,必須在核中進(jìn)行復(fù)制。

細(xì)胞核又是細(xì)胞遺傳性和細(xì)胞代謝活動的控制中心。遺傳物質(zhì)能經(jīng)復(fù)制后傳給子代,同時遺傳物質(zhì)還必須將其控制的生物性狀特征表現(xiàn)出來,這些遺傳物質(zhì)絕大部分都存在于細(xì)胞核中。


04

如何選擇對細(xì)胞核染色的染料?


1. 對死細(xì)胞染色的染料


PI是一種核酸熒光染料,可用于哺乳動物、細(xì)菌、酵母的染色。它不能透過完整的細(xì)胞膜,但能夠透過死細(xì)胞和凋亡中晚期細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染色。因此,PI 作為熒光探針常用于細(xì)胞凋亡(apoptosis)或細(xì)胞壞死(necrosis)的檢測。進(jìn)入細(xì)胞后,PI 與 DNA 和 RNA 結(jié)合,熒光強(qiáng)度增強(qiáng) 20-30 倍。在流式細(xì)胞分析中,PI 常與其他染料如Calcein-AM 、 Hoechst 33258 或 Hoechst 33342 聯(lián)合使用,來區(qū)分凋亡早晚期細(xì)胞以及死細(xì)胞。此外,PI 也常作為多色熒光染色的復(fù)染劑使用。


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Ethidium Homodimer-I (EthD-I) 是一種高親和性的熒光核酸染料,與 DNA 或 RNA 結(jié)合后,可以使熒光增強(qiáng) 30 多倍,與 DNA 結(jié)合后發(fā)紅色熒光(最大激發(fā)/發(fā)射波長分別為大約528/617nm)。常常用于哺乳動物、細(xì)菌、酵母和真菌的染色。(EthD-I)帶有較強(qiáng)正電荷,所以該染料不能穿過細(xì)胞膜進(jìn)行活細(xì)胞染色。但是 EthD-I 可以準(zhǔn)確的檢測溶液中的核酸或者解體細(xì)胞中的核酸,是一種較靈敏的核酸染色劑。


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ethidium homodimer-1(紅色)染色的結(jié)直腸癌Caco-2 3D細(xì)胞團(tuán)


7-AAD是一種非滲透性的核酸熒光染料。該染料不能透過活細(xì)胞的細(xì)胞膜,但可穿透膜損傷細(xì)胞如晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜并與其內(nèi)的DNA結(jié)合,可用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞,廣泛用于流式細(xì)胞儀。7-AAD與DNA結(jié)合后可發(fā)出強(qiáng)烈的熒光,其熒光特性與PI相似,可被488nm氬離子激光激發(fā),但其發(fā)射光譜較PI窄,且發(fā)射波長更長,對其他檢測通道的干擾更小,在多色熒光分析中是PI的最佳替代品,可與多種488激發(fā)光激發(fā)的熒光染料聯(lián)合使用,如FITC,PE等。


Oxazole yellow等同于YO-PRO-1 Iodide,是一種非細(xì)胞膜穿透性的高親和力的羰花青單體核酸綠色熒光染料,在沒有核酸的情況下基本上是非熒光的。該染料可用于鑒定凋亡細(xì)胞,Oxazole yellow可滲透進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞,對早期凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色,而碘化丙錠(PI, P4034)(一種死細(xì)胞染色)對早凋細(xì)胞保持非滲透性,但可染色晚凋細(xì)胞,這兩種染料結(jié)合使用,可以區(qū)分早凋細(xì)胞和晚凋細(xì)胞。由此,本司推出了Oxazole yellow和PI聯(lián)合的膜透性細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,用于區(qū)分早凋和晚凋細(xì)胞。以貼壁細(xì)胞(96孔板)舉例,每孔100 μL染色工作液,配置為工作液(5 μM)大概可以用于2000個孔的染色。


DAPI 是一種可對DNA 染色的細(xì)胞核染色試劑,它在嵌入雙鏈DNA后釋放藍(lán)色熒光。DAPI 常用于細(xì)胞凋亡檢測,染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。盡管DAPI 不能通過活細(xì)胞膜,但卻能穿透擾亂的細(xì)胞膜而對核染色。DAPI 具有很高的光漂白承受水平,能用來檢測酵母線粒體DNA,葉綠體 DNA,病毒DNA,microplasmDNA 以及染色體DNA。DAPI-DNA 復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為 360 nm 和 460 nm。


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DAPI將細(xì)胞核染為藍(lán)色


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2. 對活細(xì)胞染色的染料


Draq 5 是一種遠(yuǎn)紅外熒光活細(xì)胞 DNA 染料,是一種對雙鏈 DNA 具有高親和力的蒽醌染料。它是一種可以透過細(xì)胞膜的染料,可標(biāo)記活細(xì)胞或固定后/死細(xì)胞。在流式細(xì)胞術(shù)中,這種染料可用于區(qū)分有核和無核細(xì)胞。由于 Draq5能夠按照化學(xué)計(jì)量比結(jié)合至 DNA,因此還可用于報(bào)告細(xì)胞核 DNA 含量,適用于染色體倍數(shù)和細(xì)胞周期分析。在熒光顯微鏡分析中,它可用作細(xì)胞核復(fù)染劑。Draq5 有很多應(yīng)用,高度兼容現(xiàn)有儀器平臺廣泛使用的程序,主要的應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)?HCS,細(xì)胞模型,GFP,流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡。


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Draq 5 將細(xì)胞核染為藍(lán)色


Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光 染料,對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33342 染色常用于細(xì)胞凋亡檢測,染色后用熒光顯微鏡觀察或流 式細(xì)胞儀檢測。Hoechst 33342 也常用于普通的細(xì)胞核染色,或常規(guī)的 DNA 染色。Hoechst 33342 染色液可直接用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色,也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。

Ex/Em(結(jié)合DNA)= 346/460 nm

Ex/Em(未結(jié)合DNA)= 350/ 461nm


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Hoechst 33258,也稱bis Benzimide H 33258或HOE 33258,是一種非嵌入性的亮藍(lán)色熒光染料。染料在溶液中熒光較弱,它們在活細(xì)胞中DNA聚AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合后熒光變得明亮,故此類染料也被稱為DNA探針。因背景較低,故染色細(xì)胞不需洗滌步驟,且染色非常穩(wěn)定,對活細(xì)胞無毒,結(jié)合DNA染色后可持續(xù)幾天或更長時間。Hoechst 33258與Hoechst 33342相比在水中的溶解度要高,但兩種染料均具有高細(xì)胞膜滲透性,被廣泛用于細(xì)胞凋亡檢測,染色后可用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。

Ex/Em(結(jié)合DNA)= 352/461 nm

Ex/Em(未結(jié)合DNA)= 346/460 nm


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