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A1: 目前培養(yǎng)的類器官主要來源于上皮細(xì)胞，對于非上皮細(xì)胞來源的類器官培養(yǎng)方式還需要進(jìn)一步研究。

A2: 常見的類器官根據(jù)起始細(xì)胞的類型，可以分為兩種：

（1）腫瘤組織來源的腫瘤類器官；

（2）干細(xì)胞來源的類器官，包括：多能性干細(xì)胞 (PSC) /成體干細(xì)胞 (ASC)以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)。

A3: 類器官并不是單一細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)，而是由具有干細(xì)胞性質(zhì)的起始細(xì)胞進(jìn)行分裂和分化，并將多種類型的細(xì)胞自組裝的結(jié)構(gòu)，自組裝后的形態(tài)和功能與體內(nèi)相應(yīng)器官相似。

A4：可以的。已有學(xué)者驗(yàn)證過，將人結(jié)腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術(shù)組織切碎后，以梯度降溫的方式進(jìn)行冷凍，最終在液氮中保存15-18個(gè)月后進(jìn)行復(fù)蘇和原代細(xì)胞提取，分別對細(xì)胞進(jìn)行2D和3D培養(yǎng)，證實(shí)了凍存對于細(xì)胞活力和生長速度均無顯著影響^【1】。

當(dāng)然，由于組織來源不同、凍存條件不同，還需要大家根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行驗(yàn)證，新鮮組織提取的細(xì)胞依然是3D培養(yǎng)的最佳選擇。

A5：類器官可以凍存，通常會(huì)在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達(dá)到最佳的效果，可以選擇類器官成熟（傳代7-10次）后再進(jìn)行凍存。

A6：是的，主要的原因是類器官內(nèi)部缺乏循環(huán)系統(tǒng)。

當(dāng)類器官的尺寸較大時(shí)，靠近中心的細(xì)胞難以和外界進(jìn)行氧氣和營養(yǎng)成分的交換。因此這個(gè)結(jié)構(gòu)尺寸越大，死亡的細(xì)胞就越多（如圖1）^【2】。我們在培養(yǎng)的過程中，需要控制類器官的大小在4-5mm以內(nèi)。未來的類器官技術(shù)可以與血管類器官結(jié)合在一起，建立一個(gè)功能性的封閉循環(huán)系統(tǒng)，用以培養(yǎng)出更大尺寸的類器官。

A7：類器官的傳代通常是根據(jù)培養(yǎng)的時(shí)間判斷。一般在7-14天時(shí)進(jìn)行第一次傳代，后續(xù)則每7-10天傳代一次^【3】。

A8：大部分類器官可以在體外連續(xù)傳代10次（>6個(gè)月），甚至有些類器官可以連續(xù)傳代20次（>12個(gè)月）并且維持原有的生長速度^【4】。

A9: 初步可以通過顯微鏡和H&E染色觀察形態(tài)；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)檢測該類器官是否表達(dá)相應(yīng)的biomarker；基因測序可以鑒定所培養(yǎng)的類器官是否有某些特征丟失；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動(dòng)。

A10: 在進(jìn)行類器官培養(yǎng)前，我們需要了解該器官在體內(nèi)的發(fā)育過程，及早期發(fā)育相關(guān)的信號通路。

以胃類器官培養(yǎng)為例：胃由前后腸發(fā)育而來，早期發(fā)育需要由多種信號通路共同調(diào)控。那么在體外我們需要通過添加細(xì)胞因子的方式，指導(dǎo)激活/抑制相應(yīng)的信號通路，來達(dá)到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化為內(nèi)胚層，Wnt3a、FGF-4和Noggin指導(dǎo)細(xì)胞向向前腸分化^【5】。

A1: 類器官是由不同類型的細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)，并且在體外是自組裝的，因此很容易存在同一樣本在相同培養(yǎng)條件下的孔間差異。

如果是用于患者個(gè)性化醫(yī)療的腫瘤類器官，需要更精準(zhǔn)地模擬患者體內(nèi)的特征，這種情況建議采用多個(gè)平行來減小差異；

如果是用于機(jī)制研究或用作疾病模型的類器官，可以考慮利用“微流控液滴技術(shù)”進(jìn)行工程化培養(yǎng)，相關(guān)成果已發(fā)表在Cell Reports Medicine^【1】。

A2：已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)過可行性，比如：腸類器官移植小鼠治療潰瘍性結(jié)腸炎^【2】；胰島類器官移植小鼠治療糖尿病^【3】。

雖然目前類器官移植尚未進(jìn)入臨床，但在2021年2月，Science^【4】首次報(bào)道了利用膽道類器官修復(fù)離體條件下的人類肝臟，實(shí)現(xiàn)了膽道再生，并改善了膽汁性質(zhì)。

A3：這個(gè)問題可以在Nature Protocols^【5】找到答案。

對于新鮮培養(yǎng)的類器官：建議對低代次類器官（2-3代）進(jìn)行藥物篩選，以最大限度地減少使用過的培養(yǎng)基或體外突變累積對藥物測試的影響。

對于經(jīng)過凍存的類器官：由于冷凍/解凍可能導(dǎo)致復(fù)蘇時(shí)器官樣形態(tài)的變化，因此建議類器官至少傳代一次再進(jìn)行藥物篩選。如果出現(xiàn)復(fù)蘇后細(xì)胞活力不佳，則需要延長培養(yǎng)時(shí)間以恢復(fù)細(xì)胞狀態(tài)。

A4：1、判斷形態(tài)。顯微鏡下類器官形態(tài)可能為空泡狀、出芽狀、緊密型、松散型等，但整體形態(tài)一致。

2、可以鑒定相應(yīng)的biomarker是否有表達(dá)，及分布是否與組織切片相似。

3、是否能夠傳代3次以上，并可以凍存復(fù)蘇。

4、如果有條件的話，可以進(jìn)行測序分析。

A5：可以，干細(xì)胞來源類器官的基因編輯多用于疾病建模，而腫瘤來源的類器官則多用于尋找疾病相關(guān)突變點(diǎn)或治療靶點(diǎn)，圖1列舉了類器官基因編輯的部分研究和應(yīng)用。

A6：1、細(xì)胞來源有區(qū)別：類器官的細(xì)胞來源是具有多能性的上皮細(xì)胞，而普通細(xì)胞培養(yǎng)適用于培養(yǎng)多種類型細(xì)胞；

2、 細(xì)胞培養(yǎng)方式不同：1）類器官需要基質(zhì)膠等材料支撐其三維結(jié)構(gòu)，普通細(xì)胞培養(yǎng)則不需要；2） 類器官需要實(shí)現(xiàn)體外分化和自組裝，因此需要多種細(xì)胞因子的組合進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)基成分復(fù)雜。而普通細(xì)胞培養(yǎng)通常為單一種類細(xì)胞，因此培養(yǎng)基成分較簡單；

A7：通常來講，如果腫瘤發(fā)生了轉(zhuǎn)移，我們依然選用相對應(yīng)的原發(fā)灶（A類型）PDO培養(yǎng)基。

A8：類器官的分化方式本質(zhì)上是在模擬體內(nèi)的器官發(fā)育，因此表達(dá)形態(tài)及各細(xì)胞分布情況與實(shí)際器官具有相似性，而細(xì)胞團(tuán)則沒有這種規(guī)律。我們可以通過免疫熒光的方式檢測biomarkers的分布情況來區(qū)分。例如下圖中的結(jié)果表明，腎類器官與腎組織的biomarkers分布高度一致^【7】。

A9：由于類器官涉及到體外分化和自組裝，因此來源細(xì)胞必須具有多能性。正常組織的成熟體細(xì)胞中往往會(huì)有一部分成體干細(xì)胞（標(biāo)志物為Lgr5，CD133等），這部分細(xì)胞也可以進(jìn)行類器官培養(yǎng)。

A10：依據(jù)Hans Clevers實(shí)驗(yàn)室早期發(fā)表的文章，可以采用條件性培養(yǎng)基代替純化的細(xì)胞因子進(jìn)行類器官培養(yǎng)，但同時(shí)也需要考慮條件性培養(yǎng)基的不足之處。小編總結(jié)了條件性培養(yǎng)基和近岸細(xì)胞因子的參數(shù)差異。

A2：考慮到DMSO這類有機(jī)物的細(xì)胞毒性，建議終濃度不超過0.1%（v/v）。

A3：黑色小顆粒大概率是雜質(zhì)或細(xì)胞碎片，去除它們有以下兩種方式可以參考：

1、將類器官消化下來，用培養(yǎng)基進(jìn)行反復(fù)清洗，達(dá)到稀釋雜質(zhì)的作用；

2、用無菌手術(shù)刀將類器官切成兩半，取1ml注射器吸滿培養(yǎng)基并輕輕推出，沖洗類器官中的雜質(zhì)^【2】。

A4：PDO、PDX、PDXO模型有各自的優(yōu)勢，通常有以下兩種結(jié)合方式：PDO-PDX和PDX-PDXO。

1、PDO-PDX是性價(jià)比更高的方式，即：先利用PDO進(jìn)行高通量的藥物篩選，篩選出有效的藥物再進(jìn)行PDX測試。

2、PDX-PDXO是更精準(zhǔn)的藥物測試方式，即：先利用PDX產(chǎn)生大量的體內(nèi)腫瘤，然后將這些腫瘤分離進(jìn)行PDXO培養(yǎng)，此時(shí)可以通過PDX模型，將PDXO的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)用藥結(jié)果一一對應(yīng)，進(jìn)而預(yù)測人體用藥的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對患者更精準(zhǔn)的用藥指導(dǎo)；并且可以用PDX模型將轉(zhuǎn)移后的腫瘤分離，同樣進(jìn)行PDXO培養(yǎng)和用藥，能夠更精確地對轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行藥物篩選。

A5：1、將類器官放置在冰上，待基質(zhì)膠融化后離心進(jìn)行回收，這種方式適用于不需要將類器官結(jié)構(gòu)完全打散的情況；

2、市售的細(xì)胞回收液，可以溫和有效地獲得細(xì)胞懸液，不會(huì)損傷細(xì)胞或細(xì)胞表面蛋白。

A6：基質(zhì)膠能夠?yàn)轭惼鞴偬峁┲巫饔?，目前類器官培養(yǎng)用的基質(zhì)膠來源于小鼠肉瘤的基底膜基質(zhì)，其中含有約60%層粘連蛋白、30% IV 膠原和8%的巢蛋白，還含有基底膜聚糖、TGF-?、表皮生長因子、類胰島素生長因子、組織纖溶酶原等1800多種獨(dú)特的蛋白質(zhì)。由于基質(zhì)膠中各因子的不確定性，并且存在批次間差異，因此目前也有一些聚焦于基質(zhì)膠替代方案的研究，如圖2^【3】。

A7：1、根據(jù)所模擬的器官自身生長情況選擇，例如：皮膚的正常生長是有一面需要接觸空氣，那么對于皮膚類器官的培養(yǎng)傾向于利用氣-液交互法來培養(yǎng)^【4】；

2、考慮所培養(yǎng)的類器官模型的應(yīng)用方向，例如：氣-液交互法培養(yǎng)易于進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)，因此用于病毒感染實(shí)驗(yàn)的氣道類器官會(huì)優(yōu)先選擇氣-液交互法培養(yǎng)^【5】。

A8：藥物篩選前，通常將類器官吹散后，用含2%-5%基質(zhì)膠的培養(yǎng)基懸浮，并最終鋪在基質(zhì)膠包被的孔板中^【6-7】。

A9：建議采用水平轉(zhuǎn)子代替角轉(zhuǎn)子，可以有效減少類器官掛在離心管壁的情況。

A10：1、抗體藥物因?yàn)樾枰庖呒?xì)胞的參與，因此腫瘤類器官不能篩選抗體類藥物，此類藥物篩選需要構(gòu)建腫瘤類器官-腫瘤微環(huán)境的模型來實(shí)現(xiàn)；

2、由于腫瘤類器官中沒有對血管進(jìn)行培養(yǎng)，因此抗血管類的藥物也同樣不能進(jìn)行篩選。